Bacillus thuringiensis ve Sivrisineklere Etkisi
ADÜ Parazitoloji ABD Yüksek Lisans Öğrencisi
Canberk KOÇ
İçindekiler
B. thuringiensis Kristal Toksinlerinin Yapıları
Toksinlerin Sivrisineklere Etkisi
B. thuringiensis Kullanımının Artıları ve Eksiler
Sivrisineklerin Taşıyabileceği Hastalıklar
Basillus thuringiensis
Bacillus thuringiensis (BT) gram pozitif, aerobik bir toprak bakterisi olup sporlanırken ürettiği delta-endotoksin olarak da bilinen kristal proteinler (Cry) sayesinde kristal proteinin türüne bağlı olarak farklı Diptera alttürleri ile mücadelede kullanılır. B.cereus ve anthrax hastalığına neden olan B.anthracis ile yakın akraba olup temel olarak plazmid farkları ile ayırt edilirler. Sporulasyon sırasında özellikle Lepidoptera (kelebekler), Coleptera (kınkanatlılar) ve Diptera (iki kanatlılar,sinekler) takımı böcekler üzerinde toksik etki gösteren bir ya da daha fazla inklüzyon cisimcikler üretmeleri ile B. cereus’dan ayrılır. Bu kristal inklüzyonlar monomerik yapıdaki 130–140 kDa ağırlığındaki proteinlerden oluşurlar. Proteolitik enzimler tarafından inklüzyonların parçalanması sonucunda daha küçük toksik proteinler (delta endotoksinler) açığa çıkar. Bunlar suşlar arasında çeşitlilik gösterirler fakat çoğu durumlarda B. thuringiensis suşları delta endotoksinlerin karışımını içeren inklüzyonlar üretirler. Diğer alttürleri gibi endospor üretme yeteneğine sahiplerdir. ( bu da aynı kaynaktan yani 1) B. thuringiensis suşları yaklaşık 2,4 ile 5,4 milyon baz çifti uzunluğunda bir genoma sahiptirler. Büyüklükleri 2–272 kb arasında olan 2 ile 11 tane plazmit taşımaktadırlar ve insektisidal proteini kodlayan genler bu plazmitler üzerinde yer almaktadır. Büyük ve küçük plazmitler üzerinde bulunan Cry genlerinin etrafında çok sayıda hareketli bölgeler bulunmaktadır. Bu plazmitler konjugasyon benzeri mekanizmalar ile bir B. thuringiensis’den diğerine kendiliğinden transfer olma yeteneğine sahiptir.
Bacillus thuringiensis suşları toprak, depolanmış ürünler, böcek ölüleri, tahıllar, tarımsal topraklar, farklı bitki ve sucul çevreler gibi çok farklı ortamlardan izole edilebilirler.
Cry4 ve Cyt Genleri
Kristal protein genlerinin cry4 sınıfı, Diptera takımına özgü kristal protein genlerinin oldukça heterojen bir grubundan oluşur. B.thuringiensis subsp. israelensis suşunda bulunan 72 MDa büyüklüğündeki plazmitten izole edilen cry4A, cry4B, cry4C ve cry4D genlerinin kodladığı proteinler sırasıyla 135, 128, 78 ve 72 kDa ağırlığındadır. Bu proteinler 27 kDa ağırlığındaki Cyt geninin ürünü ile birlikte yuvarlak yapılı kristallerde toplanırlar.
Kristal genler tarafından sentezlenen toksinlerinin moleküler büyüklüğü ve konak özgünlüğü aşağıda görülmektedir.
Cry toksinleri Diptera’nın yanı sıra Lepidoptera, Coleoptera, Hymenoptera ve Nematodlara karşıda etkilidir. İki önemli alttürlerinden kurstaki daha çok tarımda kulanılırken, israelensis sineklerde etkilidir. Bu yüzden BT biyolojik yöntemle mücadelede oldukça yaygındır. İnsekt Cry toksinleri sindirdiğinde sindirim bölgelerinde alkali Ph seviyesi ve bazı özel enzimler toksinleri aktive eder ve bu toksinler bağırsak membranına bir gözenek formunda sızar. Bu gözenek hücre yıkımına ve doğal olarak insektin ölümüne yol açar.
B. thuringiensis Kristal Toksinlerinin Yapıları
Cry toksinlerinin üç boyutlu yapıları, toksinlerin fonksiyonlarını anlamamızda önemli ölçüde katkı sağlamakla beraber aralarındaki yapısal farklılıkları anlamamıza da yardımcı oldu Bugüne kadar X-ray kristalografi yöntemi ile yedi toksin detaylı olarak incelendi: Cry1Aa (64), Cry1Ac (32, 108), Cry2Aa (127), Cry3Aa (109), Cry3Ba (45), Cry4Aa (12) ve Cry4Ba (11). Bu toksinler amino asit sekansları ve etki ettikleri insektler göz önüne alındığında önemli ölçüde farklıdır. Fakat hepsi oldukça benzer üç domain’li yapıdadır.
Domain I
Domain I ilk olarak Cry3Aa’da anlaşılmıştır. İçinde bir heliks yığınının etrafında toplanmış altı heliks yığını olmak üzere toplam yedi heliks yığını vardır. Bu dışarıda kalan heliksler amfifil yapıda olup polar yada yüklü tarafları genelde çözülmeye karşı korunmasızken hidrofil kısımları tipik olarak aromatiktir ve merkezde kalan heliksin etrafını sarar. Bu domain orta bağırsak zarına tutunmadan ve por oluşumundan sorumludur.
Domain II
Domain II antiparalel 3 beta pilili yapıdan oluşur. Bu yapıların Cry toksinleri arasında çok fazla değişkenlik göstermesi, toksin etkilerinin farklılıklarında önemli olduğunu gösterir. Cry2Aa ve Cry4Ba birbirinden oldukça farklı yapılardır. Bu domaindeki benzerlikler ise bağlanma bölgelerindedir.
Domain III
Domain III beta sandviç yapısında olup iki antiparelel beta-pilili yapıyı da içine alır. Bu domain toksinler arasında yapısal olarak benzerlik gösterse de bazı temel özellikleri ile farklılıklar gösterir. Mesela Cry1Ac N-acetylgalactosamine (GalNAc) adında kendisine özgü bir bağlanma reseptörü içerir.
Cyt Proteinleri
Cyt proteinlerin üç boyutlu yapısının incelenmesi sonucunda bir β-pilili tabakanın etrafına sarılmış, sarmal yapıda iki α-sarmal yapıyı taşıyan tek bir α- β bölgeden oluştuğu belirlenmiştir. Cyt proteinler yapısal olarak Volvariella volvacae mantarı tarafından üretilen volvatoksin A2 ile benzerdir.
Membran Bağlanma Yapıları
APN
APN (Aminopeptidaz N) sınıfı enzimler polipeptidin nötr amino asitlerini N’ ucundan keser. Oldukça fazla ve farklı işlevleri vardır fakat larva orta bağırsağında endopeptidazlar ve karboksipepdidazlarla birlikte proteinleri sindirmek için kullanılırlar.
ALP
ALP (Alkalin Fosfataz) bir Cry toksin reseptörü olarak tanımlanmıştır. ALP M.sexta ve H. Virenscens de Cry1Ac reseptörü olarak ve bizim için önemli olan Aedes aegypti’de Cry11Aa reseptörü olabileceği ilk çalışmalarda bulunmuştur. ALP proteini 65 kDa olup membrana GPI (Glycosylphosphatidylinisotol) çapası ile bağlanır. Bu çapa BBMV’de (fırçalı kenar zar vezikülleri) baskın protein olup tahminen membran proteinlerinin %15-20’sini oluşturur. İmmunoflorasan çalışmaları ALP’nin kör bağırsak ve arka bağırsakta yerleştiğini göstermiştir
GPI Çapası
GPI çapası (Glycosylphosphatidylinositol) Protein membrandan geçerken C’ ucundan bağlanarak geçişi gerçekleştiren bir glikolipittir.
Toksinlerin Sivrisineklere Etkisi
Bt. Alttürü olan israelensis (BTi), Aedes, Culex ve Anopheles cinsi sivrisineklerde oldukça zehirlidir. (Margalith and Ben-Dov, 2000). Bu bakteri Cry4Aa, Cry4Ba, Cry10Aa, Cry11Aa, Cyt1Aa ve Cyt2Ba toksinlerini içerir. (Berry et al., 2002). Yukarıda anlatıldığı gibi, sivrisineklerde etkili olan Cry11Aa, Cry4A ve Cry4B, lepidopteralarda etkili olan Cry1A ile benzer yapıda bulunur ve etkileride vektör üzerinde benzerdir.
Genel olarak endotoksinler ile muamele edilmiş yiyeceklerin tüketimi, Lepidoptera larvalarının beslenmesinin durmasına ve bağırsağın felç (paraliz) olmasına neden olur. Toksinlerin yüksek dozuyla beslenen larvalar genel bir felç olayı geçirir ve ölür. Toksinin yüksek dozlarda uygulanması sonucunda orta bağırsak epiteli parçalanır ve hızlı bir ölüm gerçekleşir. Daha düşük dozlarda ya da daha az duyarlı böceklerde, bağırsak hücrelerinin zarar görmesi normal bağırsak salgısının durmasında etkilidir ve bu olay da sporların açılmasına izin verir. Vejetatif hücreler daha sonra içeri girerek septisemiye neden olur ve ölüm gerçekleşir.
Sivrisineklerde kristal toksinler duyarlı larvalar tarafından sindirilirler ve alkaline bağırsak ortamında dağılırlar. 70 kDa Cry11Aa protoksin, bağırsağın uygun ortamında N-ucunda bulunan 28 artık amino asitten kurtularak 34 ve 32 kDa’luk iki parçaya ayrılır. Fakat bu parçalar birbirleriyle bağlantılıdır ve toksin etkilerini kaybetmezler. (Dai and Gill, 1993) (Yamagiwa et al., 2004). 130 kDa olan Cry4Ba protoksini de hem N ucundan hemde C-ucundan ayrılmalar ile 18 ve 46 kDa’luk iki proteine ayrılır. (Angsuthanasombat et al., 1993; Komano et al., 1998). Cyt toksinleri de protoksin olarak sentezlenir ve aktif olmak için her iki ucundan amino asit bırakırlar. (Armstrong et al., 1985, Gill et al., 1987; Li et al., 1996). Cyt2Aa, 32 amino asit N-ucundan 15 amino asit C-ucundan proteinaz K yardımı ile kopar ve hemolytic aktiviteli bir monomerik protein oluşur (Koni and Ellar, 1994).
Sivrisineğin orta bağırsak membranlarına reseptörlerin bağlanması
Cry toksinleri sivrisinek orta bağırsağında ki mikrovililerde bulunan spesifik protein reseptörlerine bağlanırken, Cyt toksinleri protein reseptörlerine ihtiyaç duymaksızın membran yağlarında delikler oluşturacak biçimde sızarlar ya da membranı direk yok ederler. (Butko, 2003).
Sivrisinek toksinleri olan Cry4A, Cry4B ve Cry11Aa domain II bölgesinde toksin etkilerini ve reseptör bağlanma bölgelerini bulundururlar. Cry4Ba Culex türünde toksin etki göstermezken Cry4Aa 3 bölgesinde oluşan mutagenensis ile Culex türlerine karşı da etkilidir. (Abdullah et al., 2003). Fakat bu 3 bölgenin birinci ve ikincisinde yaşadığı mutagenesis yüzünden de Aedes ve Anopheles türlerine karşı olan toksin etkisini yitirmiştir. (Abdullah et al., 2003). Yani domain II de bulunan bölgeler Cry toksinlerinin sivrisinek orta bağırsağına bağlanabilmesinde çok önemlidir.
Cry11Aa ve Cry4Ba toksinleri ve bağlanma proteinleri, Ae.aegypti larvalarının BBMV(fırçalı kenar zar vezikülleri)’sinde yapılan çalışmalarda 65 ve 62 kDa olarak tespit edilmişlerdir. (Buzdin et al., 2002). Çalışmalar Ae. Aegypti de 200, 100 ve 65 kDa olan üç reseptör proteininin Cry toksinleri sivrisinekler membranında tuttuğunu göstermiştir. Bu proteinlerden 100 ve 65 kDa olanları GPI tarafından membrana bağlanır. (Fernández et al., 2006). Ae. aegypti GPI-ALP proteini Cry11Aa’nın toksin etkisinide açığa çıkarır. Tüm bu bilgiler GPI-ALP reseptörünün Cry11Aa toksini için çok önemli olduğunu gösteriyor.
Anopheles quadrimaculatus’da, GPI’a bağlanan APN adında bir proteinin Cry11Ba için reseptör olduğu belirlenmiştir. Fakat aynı protein Cry4BA ve Cry11Aa da işe yaramaz (Abdullah et al., 2006).
Gördüğümüz gibi bir çok türde membrana bağlanma ALP yada APN yapısında olan GPI bağlayıcıları ile gerçekleşiyor. (Fernández et al., 2006; Abdullah et al., 2006).
B. thuringiensis Kullanımının Artıları ve Eksileri
BT’nin mekanik ( bataklık ve sulak alanları kurutma veya sazlık gibi bölgeleri yakma) ve kimyasal ( bazı gazlar ve diğer kimyasallar) gibi diğer mücadele yöntemleri ile kıyaslandığında bir çok artısı olmasının yanı sıra bazı dezavantajları da beraberinde getirir.
En büyük artısı spesifik olması ve insanlara veya diğer vahşi hayata zarar vermemesi olabilir. Ayrıca maliyet düşüklüğü de bir diğer büyük avantajı. İlk tesisten sonra kendi kendine üremesi ve devamlılığı, maliyeti düşürdüğü gibi uzun süreli etki etmesini de sağlar.
Sivrisineklerle mücadelede BT kullanımının eksilerine gelince, ilk akla gelen etki süresinin ilk tesiste oldukça uzun sürmesidir. Işığa fazla duyarlı olan Bt.’nin ortalama ışığa dayanabilme süresi bir haftadır. Hatta bazı alttürleri bir günden daha fazla dayanamayabilir. Etkili bir mücadele için öngörülen zaman üç yıldır. Akıcı ve kirli sularda etkisi çok zayıftır. Ayrıca iyi araştırma yapılmadan kullanımında çevre ekinlere, diğer yararlı insektlere etki ederek dolaylı yoldan zararlar verebilir. Bazı arı üreticileri, mevsim değişikliğinden dolayı yer değiştirirken bu bakteriler, arıların büyük çoğunluğunun ölümüne neden olabiliyor. Fakat eksileri çoğunlukla insan hatalarından kaynaklandığı için günümüzde iyi bir başlangıç çalışması ile minumuma düşürülebiliyor.
Sivrisineklerin Taşıyabileceği Hastalıklar
Son olarak sivrisineklerce taşınan virüs ve parazitlerin oluşturabileceği başlıca hastalıklar olan sarı humma, sıtma ve fil hastalığı konularını ele alalım.
Öncelikle sıtmadan bahsedelim. Sıtma (Maleria – İtalyanca “kötü hava”) dişi anofel sivrisineklerin sokması ile bulaşan bir hastalıktır. Etkeni plasmodium parazitleridir. Dört tipi vardır. P.vivax, P.ovale, P.maleria ve P. Falciparum. Sivrisinek midesinde oluşan kistler sokulan canlıya aktarılır. Bu parazitler öncelikle canlının karaciğerine gider ve burada yapısal bir değişikliğe de maruz kalarak çoğalır (şizogeni ile) ve binlerce yeni parazit (merezoid) karaciğer hücresinin (hepatositler) lize olmasıyla kan dolaşımına katılır. Burada ise olgun parazitin çoğalabileceği alyuvar hücrelerinin içine süzülerek orada çoğalır ve hücreyi lize ederek tekrar dolaşıma katılır. Hastalık dünya genelinde oldukça yaygındır. Yılda yaklaşık bir milyon kişinin ölümüne yol açar.
Sarı humma ise, flaviviridae ye bağlı sarı humma virüsü tarafından bulaşır. Bu hastalığı taşıyan sivrisinek cinsi Aedes aegypti’dir. Hastalık Güney Amerika ve Afrika’da görülür. Virüs taşıdığı 40-50 nm’lik RNA materyalini canlıda çoğaltarak çeşitli rahatsızlıklara neden olur. Siyahi insanlar bu hastalığa karşı doğuştan bağışıktırlar.
Fil hastalığı, Wuchereria bancrofti ve Brugia malayi adındaki ipliksi solucanların sivrisineklerce taşınması yoluyla bulaşan bir hastalıktır. Güney Amerika’da özellikle kuzey sahillerinde ve Brezilyanın bazı iç bölgelerinde, Afrika’da kuzey sahillerinde ve orta Afrikanın tamamında, Asya’da ise Çin, Vietnam ve özellikle Hindistan’da görülür. Bu hastalıkta lenf damarlarının tıkanması ile iltihap oluşur ve lenf deri altında birikmeye başlar ve deri aşırı derecede şişer.
KAYNAKÇA
- Babu M, Geetha M. "DNA shuffling of Cry proteins". Retrieved 2008-11-23.
- Dean D.H. ( October 1984)."Biochemical Genetics of the Bacterial Isect-Control Agent Bacillus thuringiensis:Basic Principles and Prospects for Genetic Engineering". Biotechnology and Genetic Engineering Reviews-vol.2,341-363.
- a b Madigan M, Martinko J (editors) (2005). Brock Biology of Microorganisms (11th ed.). Prentice Hall. ISBN 0-1....
Carlson, C. R., Caugant, D. A., Kolsto, A. B., “Genotypic diversity among
Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains”, Appl. Environ. Microbiol.,
60: 1719-1725 (1994).
- Gonzales, J. M. Jr., Dulmage, H. T., Carlton, B. C., “Correlation between
spesific plasmids and δ-endotoksin production in Bacillus thuringiensis”,
Plasmid, 5: 351-365 (1981).
- Lereclus, D., Delecluse, A., Lecadet, M. M., “Diversity of Bacillus
thuringiensis toxins and genes”, Bacillus thuringiensis, an Environmental
Biopesticide: Theory and Practise, Cory, P.F., Bailey, J.S., Higgs, M.J., (eds.),
John Wiley and Sons Ltd., Chichester, 37-70 (1993).
- Carlton, B., “Development of genetically improved strains of Bacillus
ıhuringiensis”, Biotechnology for Crop Protection, Hadin, P., Mann, J.,
Hollingworth, R., (eds.), American Chemical Society, Washington, D.C., 260-
279 (1988).
- Mahillon, J., Resohazy, R., Hallet, B., “IS231 and other Bacillus thuringiensis
transposable elements: a Review”, Genetica, 93: 13-26 (1994).
- Apaydin, O., Yenidunya, A. F., Harsa, S. and Gunes, H., “Isolation and
characterization of Bacillus thuringiensis strains from different grain habitats
in Turkey”, World Journal of Microbiology & Biotechnology, 21: 285–292
(2005).
- Höfte, H., Whiteley, H. R., “Insecticidal Crystal Proteins of Bacillus
thuringiensis”, Microbiol. Rev., 53: 242-255 (1989).
- Glare, T. R. and O’Callaghan, M., “Bacillus thuringiensis: Biology, Ecology
and Safety”, John Wiley and Sons, Ltd., Chichester, New York, 1-40 (2000)
- Thomas and Ellar, 1983; Gill et al., 1987; Li et al., 1996; Promdonkoy and Ellar 2003
Hiç yorum yok:
Yorum Gönder